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腫瘤細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)工作，可以解決細(xì)胞因為連續(xù)繼代造成的退變或轉(zhuǎn)化。細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)以及細(xì)胞凍存和復(fù)蘇后都需要細(xì)胞計數(shù)。那么細(xì)胞計數(shù)與存活的測試實驗方法有哪些呢？1、原理：（1）計算細(xì)胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。（2）血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細(xì)刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細(xì)刻16個小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為...

一、轉(zhuǎn)化細(xì)胞準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備工作對開展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實驗失敗或無法進行。準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試等。1、清潔、消毒、液體直接接觸細(xì)胞的用品要超凈處理——無非必須分子直接接觸細(xì)胞的用品要*消除微生物超凈和消毒過的樣品要密閉保存，標(biāo)記消毒時間實驗室保持潔凈，隨時消毒盡量采用商品化一次性用品操作者也要清潔和消毒緩沖液要符合生理滲透壓（280～3...

一旦培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長成形態(tài)上單一的細(xì)胞群體或細(xì)胞系（或株）后，不論用于實驗研究還是建立細(xì)胞系，都需要做一系列的細(xì)胞生物學(xué)測定，主要的目的在于求得證明：所培養(yǎng)的細(xì)胞系的確來源于原體內(nèi)具有惡性的細(xì)胞，而非正常細(xì)胞或其它細(xì)胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學(xué)性狀。測定項目數(shù)量無明確規(guī)定，根據(jù)需要而定，以下為常做的項目和要點。【形態(tài)觀察】主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。【細(xì)胞生長增殖】檢測細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞分裂...

成骨和成脂誘導(dǎo)是鑒定干細(xì)胞的一種重要的方法，也是zui常用、報道見得zui多的方法。成骨zui常用的染色方法是茜素紅染色（堿性磷酸酶），成脂誘導(dǎo)zui常用是OilRedO（油紅O）染色法。下面介紹一下這兩種染色方法的原理和步驟。成骨誘導(dǎo)分化茜素紅染色方法和原理：茜素紅又名茜素磺酸鈉，茜素S，茜素紅S，茜素胭脂紅，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉鹽。橙黃色或黃棕色粉末。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯。1%水溶液pH為2.15，其水溶液呈淺黃褐色，加...

轉(zhuǎn)化細(xì)胞深層培養(yǎng)可分為：分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式五種。一、分批式培養(yǎng)（batchculture）是細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)發(fā)展進程中較早期采用的方式，也是其它操作方式的基礎(chǔ)。該方式采用機械攪拌式生物反應(yīng)器，將細(xì)胞擴大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中其體積不變，不添加其它成分，待細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成積累到適當(dāng)?shù)臅r間，一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基的操作方式。該方式的特點:操作簡單。培養(yǎng)周期短，染菌和細(xì)胞突變的風(fēng)險小。反應(yīng)器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過程中與...

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。1、取材：人腫瘤細(xì)胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進行培養(yǎng)，如因故不能立即培養(yǎng)，可貯存于4℃中，但不宜栽過24小時。2、培養(yǎng)基：腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)基...

ATCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法不同，對轉(zhuǎn)染結(jié)果影響很大。常見的轉(zhuǎn)染方法有：1.磷酸鈣法：該方法利用磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞原理得到瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)果，操作簡便但重復(fù)性差，不可用于原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。2.DEAE-右旋糖苷法：帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞，可用于瞬時轉(zhuǎn)染，方法相對簡便、結(jié)果可重復(fù)但對細(xì)胞有一定的毒副作用。3.電穿孔法：利用高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染均適用。適用性廣但...

ATCC細(xì)胞發(fā)生凋亡時具有固有的形態(tài)特征,如細(xì)胞核表現(xiàn)縮小、染色質(zhì)邊緣化、凝集,凋亡晚期還會出現(xiàn)由核碎片與胞質(zhì)內(nèi)的部分細(xì)胞器混合在一起,且被細(xì)胞膜包裹形成的凋亡小體。DNA特異性染料(如Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI等)可以與DNA的A-T堿基區(qū)進行非嵌入式結(jié)合,從而使細(xì)胞核著色,在紫外光激發(fā)時會出現(xiàn)明顯的熒光。通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡可以觀察細(xì)胞染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)變化、膜結(jié)構(gòu)及通透性的改變,從而鑒別凋亡細(xì)胞、正常細(xì)胞及壞死細(xì)胞。細(xì)胞凋亡的形...

【實驗用品】材料：貼壁培養(yǎng)的ATCC細(xì)胞器材：離心機、顯微鏡、血細(xì)胞計數(shù)板試劑：Hanks液、0．25％胰蛋白酶、含10％小牛血清／胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(根據(jù)實驗需要也可以是其他種類的培養(yǎng)基)【實驗步驟】(1)用胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞置于10ml離心管中，1000r／min離心5min，棄上清。(2)加入含血清的DMEM培養(yǎng)基，制備單細(xì)胞懸液。(3)吹打均勻后，對ATCC細(xì)胞進行計數(shù)。(4)按2x104～5x104／ml的密度將細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞...

ATCC細(xì)胞實驗用品材料：貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞器材：24孔培養(yǎng)孔板、吸管、膠帽、離心管、培養(yǎng)皿、半對數(shù)坐標(biāo)紙、蓋玻片、細(xì)胞計數(shù)板、酒精棉球、酒精燈、離心機、倒置顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱試劑：Hanks液、DMEM培養(yǎng)基(含10％小牛血清)、0.25％胰蛋白酶消化液、吉姆薩染液實驗步驟(1)消化：用0．25％胰蛋白酶溶液消化處于對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，收集消化的細(xì)胞于10ml離心管中。(2)離心：500～1000r／min離心5min，棄上清。(3)加入DM...

1、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基的新鮮程度：一般加入血清后的*培養(yǎng)基，2周內(nèi)用完。否則血清有效成分失活，影響細(xì)胞培養(yǎng)。建議：*培養(yǎng)基一次不要配太多，200ml以下。或根據(jù)用量決定。2、細(xì)胞外源微生物的污染：細(xì)胞不宜長期體外培養(yǎng)，因為外源微生物污染的幾率大大提高。易發(fā)現(xiàn)和難發(fā)現(xiàn)的。影響細(xì)胞狀態(tài)。建議：實驗前凍存一批細(xì)胞，隔幾個月重新復(fù)蘇。即保證實驗所用細(xì)胞代數(shù)一致，又將外源污染的后果降到zui低。3、排除其他原因：如更換培養(yǎng)條件（血清、培養(yǎng)基等）；腫瘤細(xì)胞使用器皿的潔凈程度；人表皮黑色素細(xì)胞...

1．血管內(nèi)皮細(xì)胞重要標(biāo)志（1）轉(zhuǎn)化細(xì)胞第Ⅷ因子關(guān)連抗原，可以由全身所有血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，檢測這一因子主要用相應(yīng)抗體。VWF有其特異性，人的VWF抗體對牛的內(nèi)皮細(xì)胞沒有交叉反應(yīng)。兔疫熒光間接法測定該因子，陽性細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)長的熒光顆粒，在核周圍的顆粒較密，細(xì)胞邊緣顆粒較少。（2）Weibel-Palade小體，該小體是血管內(nèi)皮細(xì)胞又一特異性的標(biāo)志。電子顯微鏡下，呈現(xiàn)0.1～0.3μm,長0.5～5μm的橢圓形棒狀結(jié)構(gòu)。上述的VWF就是該小體產(chǎn)生的。2．培養(yǎng)的大動脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)培養(yǎng)的...